การสังเคราะห์และวิเคราะห์อนุภาคนาโนแม่เหล็กเคลือบด้วยพีเอ็มเอเอ็มพีซีโคพอลิเมอร์ (Synthesis and Char
บทคัดย่อ
อนุภาคนาโนแม่เหล็ก (magnetic nanoparticles: MNPs) สังเคราะห์โดยวิธีการตกตะกอนร่วมระหว่าง Fe2+ และ Fe3+ ในสารละลายเบส เคลือบพื้นผิวอนุภาคด้วยโคพอลิเมอร์แบบสุ่ม ระหว่างพอลิเมทาคริลิกแอซิดและพอลิ(2-เมทาคริโลอิลออกซีเอทิลฟอสโฟริลโคลีน) (poly[(methacrylic acid)-ran-(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)]) หรือพีเอ็มเอเอ็มพีซี (PMAMPC) โดยอาศัยการคีเลตระหว่างหมู่คาร์บอกซิล (carboxyl) ที่อยู่ในโครงสร้างของพีเอ็มเอเอ็มพีซีและพื้นผิวของอะตอมเหล็ก ศึกษาหาสภาวะที่เหมาะสมในการเคลือบพื้นผิวอนุภาค เช่น ความเข้มข้นของสารละลายพอลิเมอร์ และเวลาที่ใช้ในการคีเลต สามารถพิสูจน์ทราบความสำเร็จของการเคลือบพีเอ็มเอเอ็มพีซีบนพื้นผิวอนุภาคด้วยเทคนิค FT-IR (Fourier-transform infrared spectroscopy) และจากเทคนิค TEM (transmission electron microscopy) แสดงให้เห็นว่าอนุภาคนาโนแม่เหล็กเคลือบด้วยพีเอ็มเอเอ็มพีซีที่สังเคราะห์ได้มีลักษณะค่อนข้างกลม มีขนาดอยู่ในช่วง 10-50 นาโนเมตร การเคลือบด้วยพอลิเมอร์ชนิดนี้ช่วยเพิ่มความสามารถในการกระจายตัวที่ดีและมีความเสถียรในการกระจายตัวในน้ำ นอกจากนี้อนุภาคที่ผ่านการเคลือบด้วยพอลิเมอร์ยังคงคุณสมบัติที่ดีในการเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาการเปลี่ยนสีของ 3,3',5,5'-เตตระเมธทิลเบนซิดีน (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine: TMB) ในสภาวะที่มีไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (hydrogen peroxide: H2O2) ได้ แสดงให้เห็นว่าสามารถนำอนุภาคนาโนแม่เหล็กเคลือบด้วยพีเอ็มเอเอ็มพีซี (PMAMPC-MNPs) ไปประยุกต์ใช้ร่วมกับการตรวจวัดทางชีวภาพที่สามารถสังเกตเห็นการตรวจวัดได้ด้วยตาเปล่าต่อไปได้
บทนำ
อนุภาคระดับนาโนของเหล็กออกไซด์ (magnetic nanoparticle: MNPs) เป็นอนุภาคที่แสดงสมบัติทางแม่เหล็กที่สามารถตอบสนองต่อสนามแม่เหล็กภายนอกได้อย่างรวดเร็ว ในปัจจุบันได้รับความสนใจในการนำมาประยุกต์ใช้ในงานด้านต่างๆ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในทางการแพทย์ที่ได้มีการนำอนุภาคนาโนแม่เหล็กมาประยุกต์ใช้เป็นอุปกรณ์ควบคุมการปลดปล่อยและนำส่งยา หรือการนำมาประยุกต์ใช้ในเทคนิคการแยกสารชีวโมเลกุลโดยอาศัยหลักการทางอิมมูโน (immunomagnetic separation: IMS) โดยมีหลักการคือ โมเลกุลที่ทำหน้าที่เป็นตัวตรวจวัดหรือโพรบ (probe) จะถูกตรึงบนอนุภาคนาโนแม่เหล็กและถูกนำมาใช้แยกสารชีวโมเลกุลที่ต้องการออกจากสารตัวอย่างผสม สารชีวโมเลกุลที่ต้องการตรวจวัดหรือแยกจะยึดติดอยู่กับอนุภาคและถูกแยกออกจากสารละลายได้ง่ายด้วยการให้สนามแม่เหล็ก และจากการมีขนาดระดับนาโนของอนุภาคเหล็กออกไซด์ทำให้มีพื้นที่ผิวต่อปริมาตรสูงเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาต่างๆ ได้ดี โดยในปี 2007 L. Gao และคณะได้ค้นพบว่าอนุภาคนาโนของแมกเนไทต์ (magnetite: iron(II,III) oxide: Fe3O4) สามารถเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาการเปลี่ยนสีของ peroxidase substrate ในสภาวะที่มีไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (hydrogen peroxide: H2O2) ได้เหมือนกับเอนไซม์ peroxidase เช่น horseradish peroxidase (HRP) ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงสีของ peroxidase substrate ที่สามารถนำไปประยุกต์ใช้ในอุปกรณ์ตรวจวัดทางชีวภาพหรือเซ็นเซอร์ชีวภาพ (biosensor) ที่สามารถตรวจติดตามการตรวจวัดสารที่ต้องการวิเคราะห์ได้ง่ายโดยการติดตามการเปลี่ยนแปลงสีของซับสเตรท การที่จะนำอนุภาคนาโนแม่เหล็กไปประยุกต์ใช้งานมีความจำเป็นต้องมีการดัดแปรพื้นผิวให้มีความเหมาะสม เช่น การเคลือบพื้นผิวด้วยโมเลกุลขนาดเล็กหรือเคลือบด้วยพอลิเมอร์ชนิดต่างๆ แต่จากงานวิจัยที่ผ่านมาพบว่าคุณสมบัติทางแม่เหล็กและสมบัติการเป็นตัวเร่งการเปลี่ยนสีซับสเตรทของอนุภาคนาโนแม่เหล็กจะเกิดการเปลี่ยนแปลงภายหลังการเคลือบด้วยสารเคลือบชนิดต่างๆ เช่น พอลิเอทิลีนไกลคอล (polyethylene glycol: PEG) พอลิเอทิลีนอิมีน (polyethylenimine: PEI) เดกซ์แทรน (dextran) และซิลิกอนไดออกไซด์ (silicon dioxide: SiO2) โดยคุณสมบัติเหล่านี้จะมีค่าลดลงตามการเพิ่มขึ้นของความหนาแน่นและความหนาของชั้นสารเคลือบที่เคลือบอยู่บนอนุภาคนาโนแม่เหล็ก
นอกจากนี้แล้ว การพัฒนาอนุภาคนาโนแม่เหล็กให้มีความจำเพาะเจาะจงในการตรวจวัดต่อโมเลกุลเป้าหมายถือเป็นอีกปัจจัยสำคัญที่มีผลต่อประสิทธิภาพ (efficiency) ความจำเพาะเจาะจง (specificity) และความว่องไว (sensitivity) ของอุปกรณ์ตรวจวัด แนวทางหนึ่งที่นิยมนำมาใช้คือการนำพอลิเมอร์ฟิล์มบางมาเคลือบบนอนุภาคนาโนแม่เหล็กเพื่อใช้ในการตรึงสารชีวโมเลกุลที่ทำหน้าที่เป็นโมเลกุลสำหรับตรวจวัดหรือที่เรียกว่าโพรบ (probe) ข้อดีของการใช้พอลิเมอร์คือสามารถออกแบบโครงสร้างของพอลิเมอร์ให้มีหมู่ฟังก์ชันเฉพาะที่สามารถเกิดพันธะทางเคมีที่เสถียรกับสารชีวโมเลกุลได้ ประกอบกับการที่พอลิเมอร์มีปริมาณและความหนาแน่นของหมู่ฟังก์ชันที่สูงทำให้สามารถตรึงโพรบหรือให้จำนวนโมลของโพรบต่อพื้นที่ (mole of probes per unit area) ได้ในปริมาณที่สูง ซึ่งส่งผลต่อประสิทธิภาพในการตรวจวัดของเซ็นเซอร์ นอกจากนี้ พอลิเมอร์ที่ถูกออกแบบให้มีหมู่ฟังก์ชันเฉพาะที่สามารถช่วยลดการจับยึดกันอย่างไม่จำเพาะเจาะจงระหว่างโพรบและสารอื่นที่ไม่ใช่สารที่ต้องการตรวจวิเคราะห์ยังสามารถช่วยให้อุปกรณ์ตรวจวัดมีความจำเพาะเจาะจงในการตรวจวิเคราะห์เพิ่มมากขึ้น เช่น การใช้โคพอลิเมอร์แบบสุ่มระหว่างพอลิเมทาคริลิกแอซิดและพอลิ(2-เมทาคริโลอิลออกซีเอทิลฟอสโฟริลโคลีน) (poly[(methacrylic acid)-ran-(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)]: PMAMPC) ซึ่งเป็นพอลิเมอร์ที่คณะผู้วิจัยได้ทำการออกแบบให้มีส่วนประกอบของทั้งส่วนของพอลิเมอร์ที่ทำหน้าที่ในการตรึงโพรบ (หมู่คาร์บอกซิลของ PMA unit) และส่วนของพอลิเมอร์ที่ทำหน้าที่ในการเพิ่มคุณสมบัติความเข้ากันได้ทางชีวภาพ (biocompatibility) และลดการจับยึดอย่างไม่จำเพาะเจาะจง (หมู่ฟอสโฟริลโคลีนของ PMPC unit) จากการศึกษาพบว่า PMAMPC สามารถช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการตรวจวัดให้สูงขึ้น ทั้งในแง่ของการเพิ่มความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถตรวจวัด (detection limit: LODs) โมเลกุลเป้าหมายและความสามารถในการป้องกันการดูดซับอย่างไม่จำเพาะเจาะจง
คณะผู้วิจัยจึงเล็งเห็นถึงประสิทธิภาพของ PMAMPC โคพอลิเมอร์ที่สามารถนำมาใช้ในการปรับปรุงพื้นผิวของ MNPs ให้มีความเหมาะสมสำหรับนำไปประยุกต์ใช้เป็นอุปกรณ์ตรวจวัดทางชีวภาพที่สามารถตรวจวัดโมเลกุลเป้าหมายได้อย่างจำเพาะเจาะจงและสามารถสังเกตเห็นการตรวจวัดได้ด้วยตาเปล่า โดยมีจุดมุ่งหมายเพื่อศึกษาการดัดแปรพื้นผิวของ MNPs ด้วยการเคลือบด้วย PMAMPC โดยอาศัยการคีเลตระหว่างหมู่คาร์บอกซิลที่อยู่ในโครงสร้างของ PMAMPC และอะตอมของเหล็กออกไซด์ ศึกษาหาสภาวะที่เหมาะสมในการเคลือบ วิเคราะห์อนุภาคที่เตรียมได้ด้วยเทคนิค Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) และ transmission electron microscopy (TEM) และศึกษาความสามารถในการเปลี่ยนสีซับสเตรทของอนุภาคภายหลังการเคลือบด้วย PMAMPC
วิธีการ
การสังเคราะห์ PMAMPC
สังเคราะห์ PMAMPC ด้วยปฏิกิริยาพอลิเมอไรเซชันแบบแรดิคัลผ่านกลไกการเกิดปฏิกิริยาแบบ reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) ของ MA และ MPC มอนอเมอร์ (อัตราส่วนโคมอนอเมอร์ 50:50) โดยมี 4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate (CPD) และ 4,4’-azobis(4-cyanovaleric acid) (ACVA) เป็น chain transfer agent (CTA) และ radical initiator ตามลำดับ
การสังเคราะห์อนุภาคนาโนแม่เหล็ก (MNPs) ชั่ง FeCl3.6H2O 8.00 g และ FeCl2.4H2O 3.60 g อัตราส่วน 2:1 ละลายด้วยน้ำกลั่นปริมาตร 150 ml เทลงในขวดสี่คอ จากนั้นต่อเข้ากับคอนเดนเซอร์ (condenser) และอุปกรณ์ปั่นกวนโดยใช้ความเร็ว 750 รอบต่อนาที ปั่นกวนเป็นเวลา 1 ชั่วโมงภายใต้บรรยากาศไนโตรเจน จากนั้นเติม 15 mol NH4OH (pH 11) ปริมาตร 80 ml โดยทำการเติมอย่างรวดเร็ว ควบคุมอุณหภูมิที่ 50°C และปั่นกวนต่อเป็นเวลา 6 ชั่วโมงภายใต้บรรยากาศไนโตรเจน ล้างตะกอนด้วยน้ำกลั่นจนมีสภาพเป็นกลางและล้างด้วยเอทานอล ใช้แม่เหล็กดูดแยกอนุภาคออกจากสารละลาย และนำมาอบให้แห้งที่อุณหภูมิ 55°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ได้ผงของแข็งสีดำของ MNPs พิสูจน์เอกลักษณ์ด้วยเทคนิค FT-IR และ TEM
การเคลือบพื้นผิวของ MNPs ด้วย PMAMPC (PMAMPC-MNPs)
นำอนุภาคจำนวน 10 mg/ml มากระจายตัวในน้ำกลั่นด้วยเครื่อง ultrasonic จากนั้นเติม PMAMPC (Mw ≈ 50 kDa, PMA37PMPC63) ตามปริมาณที่กำหนด (5, 10, 20 และ 40 mg) และทำการ sonicate ตามเวลาที่กำหนด (15, 30, 45 และ 60 นาที) ล้างอนุภาคด้วยน้ำกลั่นหลายๆ ครั้งด้วยเครื่อง ultrasonic และใช้แม่เหล็กช่วยในการดูดแยกอนุภาคออกจากสารละลาย อบให้แห้ง และพิสูจน์เอกลักษณ์ของ PMAMPC-MNPs ที่เตรียมได้ด้วยเทคนิค FT-IR และ TEM
ศึกษาสมบัติการเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาการเปลี่ยนสีของ TMB ซับสเตรท
นำอนุภาค MNPs และ PMAMPC-MNPs มาวิเคราะห์โดยเตรียมอนุภาคที่ความเข้มข้น 50 μg/ml ในสารละลาย NaOAc บัพเฟอร์ (0.1 mol, pH 3.5) จากนั้นเติม TMB (5 μl, 10 mg/ml) และ 30% H2O2 (1.9 μl) ตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที นำสารละลายไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 652 นาโนเมตรด้วยเครื่อง UV-visible spectrophotometer ใช้ NaOAc เป็นสารละลาย blank
การพิสูจน์เอกลักษณ์ด้วยเทคนิค Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR)
เตรียมตัวอย่างโดยชั่งน้ำหนัก MNPs และ PMAMPC-MNPs 2 มิลลิกรัมผสมลงใน KBr 200 มิลลิกรัม ทำการบดและอัดให้เป็นแผ่นบาง และนำมาวิเคราะห์ด้วยเครื่องอินฟราเรดสเปกโตรมิเตอร์โหมด FT-IR ที่เลขคลื่น 400-4000 cm-1 (128 scans)
ผลและอภิปราย
การสังเคราะห์อนุภาคนาโนแม่เหล็ก (MNPs)
สังเคราะห์ MNPs โดยวิธีการตกตะกอนร่วม (co-precipitation method) ระหว่าง Fe2+ และ Fe3+ ในสารละลาย NH4OH และทำการวิเคราะห์ลักษณะทางสัณฐานวิทยาโดยใช้เทคนิค TEM พบว่าอนุภาค MNPs มีลักษณะค่อนข้างกลม และมีขนาดอยู่ในช่วง 10-50 นาโนเมตร จากการวิเคราะห์หมู่ฟังก์ชันด้วยเทคนิค FT-IR พบสัญญาณแสดงพันธะ Fe-O (bending) ที่เลขคลื่นประมาณ 560 cm-1 และพบ OH (stretching) ที่เลขคลื่นประมาณ 3500 cm-1
การเคลือบพื้นผิวของ MNPs ด้วย PMAMPC (PMAMPC-MNPs)
ในการเคลือบพื้นผิวของ MNPs ด้วย PMAMPC อาศัยการคีเลตระหว่างพื้นผิวของโลหะและหมู่คาร์บอกซิล (COOH) ที่อยู่ภายในโครงสร้างของ PMAMPC ภายหลังการวิเคราะห์ด้วยเทคนิค TEM พบว่าอนุภาคยังคงลักษณะค่อนข้างกลมและมีขนาดไม่แตกต่างไปจากอนุภาคก่อนเคลือบ แสดงให้เห็นว่า PMAMPC ที่เคลือบบนพื้นผิวของ MNPs มีลักษณะเป็นฟิล์มบาง และเมื่อพิจารณา FT-IR สเปกตรัมของ PMAMPC-MNPs จะปรากฏสัญญาณที่ตำแหน่ง 1708 cm-1 ซึ่งแสดงถึง C=O (stretching) และ 1086 cm-1 ซึ่งแสดงถึง P-O (stretching) ของหมู่ฟังก์ชันที่อยู่ในโครงสร้างของ PMAMPC และพบสัญญาณของ C-H (stretching) ที่ประมาณเลขคลื่น 2930 cm -1 ซึ่งแสดงถึง -CH2 - ในสายโซ่หลักของพอลิเมอร์ นอกจากนี้ยังปรากฏสัญญาณที่ประมาณ 1566 cm-1 และ 1400 cm-1 แสดงพันธะ C-O (symmetric และ asymmetric stretching) ซึ่งแสดงให้เห็นถึงการเกิดคีเลชัน (bidentate bonding) ระหว่างหมู่คาร์บอกนิลและพื้นผิวของอนุภาคนาโนแม่เหล็ก
จากการศึกษาหาสภาวะที่เหมาะสมในการเคลือบพื้นผิวของ MNPs ด้วย PMAMPC พบว่าความเข้มข้นของสารละลายพอลิเมอร์มีผลต่อความสามารถในการเคลือบ โดยสามารถพิจารณาได้จากความเข้มของสัญญาณ C=O ที่ตำแหน่ง 1708 cm-1 เปรียบเทียบกับสัญญาณที่ตำแหน่ง 1634 cm-1 ซึ่งเกิดจาก MNPs แสดงในเทอมของค่า transmittance intensity ratio พบว่าค่าจะเพิ่มขึ้นตามความเข้มข้น แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นของปริมาณการเคลือบ PMAMPC บนอนุภาค แต่อย่างไรก็ตาม เมื่อความเข้มข้นมีค่ามากกว่า 10 mg/ml ปริมาณการเคลือบมีค่าลดลงซึ่งอาจจะเป็นผลเนื่องมาจากความเกะกะของสายโซ่พอลิเมอร์เมื่อความเข้มข้นเพิ่มขึ้น ในขณะที่เวลาที่ใช้ในการคีเลตมีผลกระทบเพียงเล็กน้อย นอกจากนี้ยังพบว่า PMAMPC-MNPs ที่เตรียมได้มีการกระจายตัวที่ดีและมีความเสถียรในน้ำโดยไม่เกิดการเกาะรวมกันเป็นก้อนขนาดใหญ่ (aggregate) และไม่เกิดการตกตะกอน ในขณะที่อนุภาคนาโนแม่เหล็กที่ไม่ได้ผ่านการเคลือบด้วยพอลิเมอร์จะเกิดการตกตะกอน แสดงให้เห็นถึงความไม่เสถียรในการกระจายตัวในน้ำ จากผลการทดลองนี้แสดงให้เห็นว่า PMAMPC ซึ่งเป็นพอลิเมอร์ที่มีคุณสมบัติชอบน้ำ (hydrophilic polymer) จะช่วยเพิ่มสมบัติความชอบน้ำให้กับอนุภาค MNPs ทำให้อนุภาคกระจายตัวได้ดีและมีความเสถียรในการกระจายตัวในน้ำหรือในตัวกลางที่มีขั้ว สามารถเก็บอนุภาคไว้ในรูปของสารละลายได้เป็นระยะเวลานาน แต่เมื่อมีการให้สนามแม่เหล็กจากภายนอก อนุภาค PMAMPC-MNPs สามารถแยกออกจากสารละลายได้ง่าย
ศึกษาสมบัติการเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาการเปลี่ยนสีของ TMB ซับสเตรท
อนุภาค PMAMPC-MNPs ที่เตรียมได้แสดงสมบัติการเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาการเปลี่ยนสีซับสเตรท โดยสามารถเปลี่ยนสี TMB จากสารละลายใสไม่มีสีกลายเป็นสารละลายที่มีสีน้ำเงินที่สามารถสังเกตเห็นได้ด้วยตาเปล่า และเมื่อนำสารละลายไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 652 นาโนเมตรด้วยเทคนิค UV-visible spectroscopy พบว่าความสามารถในการเปลี่ยนแปลงสี TMB ซับสเตรทของอนุภาค PMAMPC-MNPs มีค่าลดลงประมาณ 22% เมื่อเปรียบเทียบกับอนุภาค MNPs ซึ่งคาดว่าเป็นผลเนื่องมาจากการที่อนุภาค MNPs ถูกเคลือบด้วย PMAMPC อาจทำให้เกิดการบดบังบริเวณพื้นผิวของอนุภาคนาโนเหล็กออกไซด์ที่ทำหน้าที่เร่งการเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันของ TMB จากการศึกษาหาความเข้มข้นต่ำสุดของอนุภาคที่สามารถเร่งปฏิกิริยาการเปลี่ยนสี TMB ซับสเตรท พบว่าในสภาวะการทดลองนี้ที่ความเข้มข้น 12.5 μg/ml คือความเข้มข้นต่ำสุดที่ทั้ง MNPs และ PMAMPC-MNPs ยังสามารถเปลี่ยนสีซับเสตรทได้ (signal to noise ratio: S/N > 1)
บทสรุป
การดัดแปรพื้นผิวอนุภาคนาโนแม่เหล็กโดยการเคลือบด้วย PMAMPC เป็นการเพิ่มสมบัติความชอบน้ำให้กับอนุภาคนาโนแม่เหล็กทำให้สามารถกระจายตัวได้ดีในน้ำและมีความเสถียร โดยสามารถทำการแยกอนุภาคออกจากสารละลายได้ด้วยการให้สนามแม่เหล็กจากภายนอก อนุภาคที่ผ่านการเคลือบด้วยพอลิเมอร์ชนิดนี้ยังคงคุณสมบัติการเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาการเปลี่ยนสีของ TMB ซับเสตรทได้ดีใกล้เคียงกับอนุภาค MNPs ที่ไม่ได้ผ่านการเคลือบ จากผลการทดลองทั้งหมดแสดงให้เห็นถึงแนวทางในการดัดแปรพื้นผิวอนุภาคนาโนแม่เหล็กด้วย PMAMPC ที่สามารถนำมาพัฒนาเป็นอุปกรณ์ตรวจวัดทางชีวภาพที่สามารถสังเกตเห็นการตรวจวัดได้ด้วยตาเปล่าต่อไป
บทความวิจัยโดยบุณยนุช บุญไสย อรวรรณ สุขสมบัติ และปิยะพร ณ หนองคาย ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยบูรพา ตีพิมพ์ในวารสารวิทยาศาสตร์บูรพา ปีที่ 19 ฉบับพิเศษ 2557 การประชุมวิชาการระดับชาติ วิทยาศาสตร์วิจัยครั้งที่ 6 หน้า 414-421 อ่านบทความฉบับเต็ม Click
Beautiful Quietness: เงียบแต่ไม่เหงา! ดินแดนแห่งการอ่านและพื้นที่ทางความคิด โลกของนักอ่านและพรมแดนแห่งความรู้ การอ่านสะท้อนความคิด ความคิดสะท้อนตัวตน ตัวตนสะท้อนจิตวิญญาณ pruetsara.wixsite.com